Diagnostic moléculaire

L'organisation génétique d'HBV est extrêmement compacte avec une partie du "core" et tous les gènes de surface (bleu) chevauchant le gène de la polymérase (bleu clair). Par conséquent, des mutations affectant un produit d'un gène peuvent affecter un autre gène. La polymérase est subdivisée en domaines fonctionnels: protéine terminale (tp), espaceur (sd), transcriptase inverse (rt) et RNAseH. Le site actif de la rt (YMDD, bleu foncé) et les séquences adjacentes sont la cible de mutations conférant une résistance aux médicaments antiviraux. La protéine "core" constitue la capside virale, tandis que l'antigène de surface constitue l'enveloppe du virus après ancrage dans une membrane lipidique d'origine cellulaire. D'autres caractéristiques importantes ne sont pas représentées ici par souci de simplicité: l'ARN pré-génomique utilisé comme matrice pour la replication de l'ADN viral, le cadre de lecture ouvert X dont la fonction est inconnue ainsi que les éléments régulateurs nécessaires à l'expression génique virale et à la replication de l'ADN viral. Les sites de liaison pour les amorces utilisées dans le diagnostic sont représentés en vert.

Identification moléculaire des mutations

L'identification des mutations ne peut être effectuée qu'après amplification par PCR de la rt à partir d'ADN extrait du plasma de patients infectés. Les amorces utilisées dans notre laboratoire sont représentées en vert sur le génome d'HBV présenté ci-dessus.

Une identification précise des mutations peut être effectuée par hybridation contre un panel de sondes (pour des mutations connues, sensibilité élevée de détection) ou par séquençage d'ADN (pour des mutations connues aussi bien que pour des mutations inconnues) à condition qu'elles représentent au moins 20% de la population des séquences. Ce niveau de détection est suffisant pour le diagnostic de routine. Une fois la séquence d'ADN déterminée, elle est traduite en acides aminés. Les mutations peuvent ensuite être identifiées après alignement de la séquence polypeptidique par rapport à des séquences de référence. Cette méthode, utilisée dans notre laboratoire, est illustrée ci-dessous à l'aide des chromatogrammes de séquençage de deux échantillons du même patient, avant (brin supérieur) et après échec de traitement avec la telbivudine (brin inférieur). La transversion G/T surlignée en bleu conduit à la mutation M204I connue pour conférer une résistance à ce médicament.